PCR, ni mmenyuko wa mnyororo wa polimerasi, ambayo inarejelea kuongezwa kwa dNTP, Mg2+, vipengele vya kurefusha na vipengele vya kukuza ukuzaji kwenye mfumo chini ya uchochezi wa polimerasi ya DNA, kwa kutumia DNA mama kama kiolezo na vianzio mahususi kama sehemu ya kuanzia ya upanuzi , Kupitia hatua za urekebishaji, upanuzi, upanuzi, n.k., mchakato wa kujinakilisha DNA ya uzi wa binti inayosaidiana na DNA ya kiolezo cha uzi wa mzazi unaweza kukuza kwa haraka na mahususi DNA yoyote inayolengwa katika vitro.
1. Moto Anza PCR
Wakati wa kuanza kwa amplification katika PCR ya kawaida sio kuweka mashine ya PCR kwenye mashine ya PCR, na kisha programu huanza kuimarisha.Wakati usanidi wa mfumo umekamilika, ukuzaji huanza, ambayo inaweza kusababisha ukuzaji usio maalum, na PCR ya kuanza moto inaweza kutatua tatizo hili.
PCR ya kuanza moto ni nini?Baada ya mfumo wa mmenyuko kutayarishwa, kirekebishaji cha enzyme hutolewa kwa joto la juu (kawaida zaidi ya 90 ° C) wakati wa hatua ya joto ya awali ya mmenyuko au hatua ya "kuanza moto", ili polymerase ya DNA iwashwe.Wakati halisi wa kuwezesha na halijoto hutegemea asili ya polimerasi ya DNA na kirekebishaji cha kuanza-moto.Mbinu hii hutumia virekebishaji hasa kama vile kingamwili, ligandi za uhusiano, au virekebishaji kemikali ili kuzuia shughuli ya polimerasi ya DNA.Kwa kuwa shughuli ya DNA polymerase imezuiliwa kwenye joto la kawaida, teknolojia ya kuanza moto hutoa urahisi mkubwa kwa kuandaa mifumo mingi ya majibu ya PCR kwenye joto la kawaida bila kutoa sadaka maalum ya athari za PCR.
2. RT-PCR
RT-PCR (Reverse transcription PCR) ni mbinu ya majaribio ya unukuzi wa kinyume kutoka mRNA hadi cDNA na kuitumia kama kiolezo cha ukuzaji.Utaratibu wa majaribio ni kutoa jumla ya RNA katika tishu au seli kwanza, kutumia Oligo (dT) kama kianzilishi, kutumia reverse transcriptase ili kuunganisha cDNA, na kisha kutumia cDNA kama kiolezo cha ukuzaji wa PCR ili kupata jeni inayolengwa au kugundua usemi wa jeni.
3. PCR ya kiasi cha fluorescent
PCR ya kiasi cha fluorescent (PCR ya Muda Halisi,RT-qPCR) inarejelea mbinu ya kuongeza vikundi vya umeme kwenye mfumo wa majibu ya PCR, kwa kutumia mkusanyo wa mawimbi ya umeme kufuatilia mchakato mzima wa PCR kwa wakati halisi, na hatimaye kutumia curve ya kawaida kuchanganua kiolezo kwa kiasi.Mbinu zinazotumika sana za qPCR ni pamoja na SYBR Green I na TaqMan.
4. Nested PCR
Nested PCR inarejelea matumizi ya seti mbili za vianzio vya PCR kwa mizunguko miwili ya ukuzaji wa PCR, na bidhaa ya ukuzaji wa raundi ya pili ni kipande cha jeni lengwa.
Ikiwa kutolingana kwa jozi ya kwanza ya primers (primers za nje) husababisha kuongezeka kwa bidhaa isiyo maalum, uwezekano wa eneo hilo lisilo maalum kutambuliwa na jozi ya pili ya primers na kuendelea kukuza ni ndogo sana, hivyo amplification na jozi ya pili ya primers, maalum ya PCR imekuwa kuboreshwa.Faida moja ya kufanya raundi mbili za PCR ni kwamba inasaidia kukuza bidhaa ya kutosha kutoka kwa DNA ndogo ya kuanzia.
5. Touchdown PCR
Touchdown PCR ni njia ya kuboresha umaalumu wa mmenyuko wa PCR kwa kurekebisha vigezo vya mzunguko wa PCR.
Katika PCR ya kugusa, halijoto ya annealing kwa mizunguko michache ya kwanza huwekwa digrii chache juu ya kiwango cha juu zaidi cha halijoto (Tm) cha vianzio.Halijoto ya juu zaidi ya annealing inaweza kupunguza kwa ufanisi ukuzaji usio maalum, lakini wakati huo huo, halijoto ya juu ya annealing itazidisha utengano wa vianzio na mfuatano unaolengwa, na kusababisha kupungua kwa mavuno ya PCR.Kwa hiyo, katika mizunguko michache ya kwanza, halijoto ya anneal kawaida huwekwa kupungua kwa 1°C kwa kila mzunguko ili kuongeza maudhui ya jeni inayolengwa katika mfumo.Wakati halijoto ya annealing inaposhushwa hadi kiwango cha juu zaidi cha halijoto, halijoto ya annealing hutunzwa kwa mizunguko iliyobaki.
6. PCR ya moja kwa moja
PCR ya moja kwa moja inarejelea ukuzaji wa DNA lengwa moja kwa moja kutoka kwa sampuli bila hitaji la kutengwa na utakaso wa asidi ya nukleiki.
Kuna aina mbili za PCR moja kwa moja:
njia ya moja kwa moja: chukua kiasi kidogo cha sampuli na uiongeze moja kwa moja kwa PCR Master Mix kwa utambulisho wa PCR;
njia ya kupasuka: baada ya sampuli ya sampuli, ongeza kwenye lysate, lyse ili kutolewa genome, chukua kiasi kidogo cha lysed supernatant na uiongeze kwenye PCR Master Mix, fanya utambuzi wa PCR.Mbinu hii hurahisisha utendakazi wa majaribio, hupunguza utumiaji wa wakati, na huepuka upotezaji wa DNA wakati wa hatua za utakaso.
7. SOE PCR
Uunganishaji wa jeni kwa upanuzi wa mwingiliano wa PCR (SOE PCR) hutumia vianzio vilivyo na ncha za ziada ili kufanya bidhaa za PCR ziunde minyororo inayoingiliana, ili kwamba katika mwitikio unaofuata wa ukuzaji, kupitia upanuzi wa minyororo inayopishana, vyanzo tofauti vya mbinu A ambamo vipande vilivyoimarishwa hupishana. na kuunganishwa pamoja.Teknolojia hii kwa sasa ina maelekezo mawili kuu ya maombi: ujenzi wa jeni za fusion;mabadiliko yanayoelekezwa kwa tovuti ya jeni.
8. IPCR
Inverse PCR (IPCR) hutumia viasili tangulizi vya kinyume ili kukuza vipande vya DNA kando na vianzio viwili, na huongeza mfuatano usiojulikana katika pande zote za kipande cha DNA kinachojulikana.
IPCR iliundwa awali kubainisha mfuatano wa maeneo ya karibu yasiyojulikana, na hutumiwa zaidi kuchunguza mfuatano wa vikuzaji jeni;upangaji upya wa kromosomu ya oncogenic, kama vile muunganisho wa jeni, uhamishaji na uhamishaji;na muunganisho wa jeni za virusi, pia hutumiwa kwa kawaida sasa Kwa mutagenesis inayoelekezwa kwenye tovuti, nakili plasmid yenye mabadiliko unayotaka.
9. dPCR
Digital PCR (dPCR) ni mbinu ya kukadiria kabisa molekuli za asidi ya nukleiki.
Hivi sasa kuna njia tatu za kuhesabu molekuli za asidi ya nucleic.Upigaji picha unategemea ufyonzaji wa molekuli za asidi nucleic;kiasi cha umeme cha wakati halisi cha PCR (PCR ya Wakati Halisi) inategemea thamani ya Ct, na thamani ya Ct inarejelea nambari ya mzunguko inayolingana na thamani ya umeme inayoweza kutambuliwa;PCR ya kidijitali ni teknolojia ya hivi punde ya Kiidadi kulingana na mbinu ya PCR ya molekuli moja ya kuhesabu ukadiriaji wa asidi ya nukleiki ni mbinu kamili ya upimaji.
Muda wa kutuma: Juni-13-2023